生物圈的小伙伴肯定還記得前段時(shí)間的一則刷屏新聞：

北京大學(xué)陳良怡教授團(tuán)隊(duì)和華中科技大學(xué)譚山教授團(tuán)隊(duì)合作，成功發(fā)明了一種新型結(jié)構(gòu)光照明超分辨顯微成像技術(shù)——海森結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡。研究成果于高水平學(xué)術(shù)期刊Nature Biotechnology（IF＝41．67）進(jìn)行了發(fā)表。

之所以轟動(dòng)，是因?yàn)樵摷夹g(shù)擁有超高的采集速度和靈敏度，以及低于共聚焦和其他超分辨成像方法（STORM／STED等）千分之一以上的光毒性和光漂白效應(yīng)，成為了目前進(jìn)行超長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞高速超分辨成像的利器。

而且，這個(gè)牛氣哄哄的技術(shù)一經(jīng)發(fā)明，便已經(jīng)奪得生物成像領(lǐng)域的好幾個(gè)“首次”：

· 首次在活體細(xì)胞中清晰解析出線粒體的內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，以及線粒體融合與裂解過(guò)程中內(nèi)膜的動(dòng)態(tài)變化；

· 首次觀察到活體細(xì)胞中線粒體嵴與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的相互作用與運(yùn)動(dòng)；

· 首次通過(guò)連續(xù)成像的形式，捕捉到了完整的囊泡分泌與融合過(guò)程中的孔道及融合中間態(tài)。

那么究竟這臺(tái)高大上儀器是怎樣被研發(fā)而出？它爆炸性的技能點(diǎn)具體又是怎樣？接下來(lái)我們就來(lái)深度解讀一下啦！

實(shí)時(shí)觀察線粒體融合分裂及內(nèi)膜動(dòng)態(tài)變化

從1994年Stefen W． Hell提出STED顯微鏡理論，到2014年三位科學(xué)家因?yàn)槌直骘@微技術(shù)獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。短短20年間，超分辨成像可以說(shuō)是聲名大噪，各種超分辨成像平臺(tái)也幾乎成為了各大高校研究所的必備。

但是，一個(gè)奇怪的現(xiàn)象讓北京大學(xué)的陳良怡教授產(chǎn)生了疑惑：雖然遍地開花，但由超分辨成像技術(shù)所帶來(lái)的生物學(xué)新發(fā)現(xiàn)卻屈指可數(shù)。究竟是何種原因，限制了超分辨顯微成像在生物研究領(lǐng)域大顯身手？

目前，主流的超分辨成像技術(shù)主要有三類：

1、基于可隨機(jī)開關(guān)的單分子熒光閃爍定位的STORM／PALM方法；

2、基于熒光蛋白受激發(fā)射損耗原理的STED方法；

3、基于結(jié)構(gòu)光調(diào)制與解調(diào)制圖像信息的SIM方法。

其中，STED通過(guò)純光學(xué)方法能夠獲得50 nm甚至更低的分辨率，不通過(guò)算法擬合重建，成像速率取決于共聚焦平臺(tái)的振鏡掃描速率。但是其明顯的弊端在于用于激發(fā)樣品的光功率是最強(qiáng)的（MW／cm2數(shù)量級(jí)，相當(dāng)于100萬(wàn)個(gè)太陽(yáng)同時(shí)在天上炙烤你的皮膚）。如此一來(lái)，既會(huì)對(duì)樣品產(chǎn)生積累的光毒性，又容易在長(zhǎng)時(shí)間的活細(xì)胞觀察過(guò)程中使樣品熒光淬滅。

STORM／PALM相對(duì)于STED來(lái)說(shuō)光照條件要稍微溫和一些（kW／cm2數(shù)量級(jí)，大概也就相當(dāng)于1000個(gè)太陽(yáng)吧），分辨率也能到50 nm以下。但由于獲得一張超分辨圖片需要基于成百上千張?jiān)嫉膯畏肿娱W爍圖像，并通過(guò)算法擬合重建。所以成像的速度也是制約其發(fā)展的重要原因。同時(shí)，STORM／PALM對(duì)于熒光標(biāo)記物的選擇是非?？量痰模虼藥缀醪荒茉谕粋€(gè)樣品上實(shí)現(xiàn)多個(gè)蛋白的超分辨觀察。

但是另外一種超分辨率方法，基于莫爾條紋效應(yīng)的SIM就不一樣了！

基于傅里葉光學(xué)和算法重建，SIM能夠用最低的光功率（W／cm2數(shù)量級(jí)）獲得長(zhǎng)時(shí)間的活細(xì)胞超分辨圖像。同時(shí)它對(duì)熒光標(biāo)記物也無(wú)選擇性，可以輕松實(shí)現(xiàn)多標(biāo)記物觀察。最重要的是由于重建一張超分辨圖像只需要9－15張?jiān)紙D像，因此SIM也是在相同成像視野下最快的超分辨方法。該方法非常適合生物樣品中快速生物學(xué)過(guò)程的記錄，如細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)和細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)學(xué)研究、離子成像以及神經(jīng)放電等等。

不過(guò)SIM也有一個(gè)明顯的劣勢(shì)——只能達(dá)到100 nm左右的分辨率。雖然使用非線性SIM成像可以使分辨率媲美其他兩種方法，但代價(jià)則是需要使用很強(qiáng)的激發(fā)光，失去了活細(xì)胞觀察的優(yōu)勢(shì)。

看準(zhǔn)了SIM成像的優(yōu)勢(shì)，陳教授團(tuán)隊(duì)便開始著手進(jìn)行線性SIM方法的優(yōu)化。為了達(dá)到88 nm，188 Hz的優(yōu)良性能，他們主要在以下幾個(gè)方面做出了努力：

1、使用高NA的物鏡，提升極限分辨率，盡可能多的接收光信號(hào)

提升成像系統(tǒng)的NA值一直是提高系統(tǒng)分辨率的不二法門。通過(guò)使用NA值高達(dá)1．7的油鏡，再加上SIM方法本身的2倍分辨率提升，Hessian－SIM系統(tǒng)的最佳分辨率可以達(dá)到88 nm。

在相同的光照條件下，以1 Hz頻率進(jìn)行拍攝1 h，傳統(tǒng)SIM使用7 ms曝光，而Hessian－SIM使用0．5 ms曝光。

陳良怡教授團(tuán)隊(duì)一直致力于對(duì)高端的生物成像技術(shù)進(jìn)行革新性的改良和研發(fā)。除了解決超分辨成像的長(zhǎng)時(shí)間或高速問(wèn)題之外，早在2014年就與程和平院士就將雙光子和光片成像技術(shù)結(jié)合開發(fā)出激發(fā)光片范圍更大同時(shí)z軸分辨率更高的成像技術(shù)（Zong W， Chen L， et al．CellRes． 2014 Sep 26． doi： 10．1038／cr．2014．124）；2017年又針對(duì)雙光子在神經(jīng)生物學(xué)應(yīng)用中的靈活性，開發(fā)出了現(xiàn)今質(zhì)量最小的頭戴式微型雙光子顯微鏡（Zong W， Wu R， Li M， ChenL， et al． Nat Methods． 2017 May 29． doi： 10．1038／nmeth．4305），解決了行為學(xué)和活體顯微觀察的矛盾。

除了科研相機(jī)外，濱松的光電器件，如光電倍增管等，也參與到了這些重要研究中。以淬煉了60余年的光電探測(cè)技術(shù)，為發(fā)展更好的科研成像技術(shù)，貢獻(xiàn)出濱松的一份力量。