microRNA（miRNA）是一類短小的非編碼RNA分子，通常由20 ~ 24個(gè)核苷酸組成。它們通過干擾靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯來調(diào)控基因表達(dá)。這種調(diào)控方式在細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和疾病發(fā)生發(fā)展等方面都具有重要意義。已經(jīng)有許多miRNA被證實(shí)其異常表達(dá)與糖尿病、心血管疾病和癌癥等疾病相關(guān)。因此，miRNA可作為特異性生物標(biāo)志物參與疾病的診斷、預(yù)后與監(jiān)測(cè)。

迄今為止，已經(jīng)報(bào)道了許多檢測(cè)miRNA的生物傳感器。但由于miRNA在細(xì)胞和體液內(nèi)的豐度較低，生物傳感器往往需要與信號(hào)擴(kuò)增策略相結(jié)合。其繁瑣的步驟和非可視化的結(jié)果限制了miRNA生物傳感器的廣泛使用，也影響了miRNA生物傳感器在實(shí)際樣本中的應(yīng)用。

針對(duì)這一問題，吉林大學(xué)電子科學(xué)與工程學(xué)院董彪教授、口腔醫(yī)學(xué)院王林教授、物理學(xué)院李亮教授課題組合作，在國(guó)際化學(xué)權(quán)威雜志Biosensors and Bioelectronics上發(fā)表了以“Aversatile upconversion-based multimode lateral flow platform for rapid andultrasensitive detection of microRNA towards health monitoring”為題的相關(guān)工作。該研究針對(duì)miRNA的檢測(cè)開發(fā)了一種側(cè)流免疫傳感器，能夠同時(shí)產(chǎn)生比色、熒光以及拉曼信號(hào)。無需額外的信號(hào)擴(kuò)增方式，傳感器可以在20分鐘內(nèi)檢測(cè)到miRNA，其檢測(cè)下限為1 fM。且該傳感器能夠應(yīng)用在實(shí)際血清及唾液樣本中，并成功區(qū)分患者和健康對(duì)照組。

圖1 用于檢測(cè)microRNA的多模側(cè)流免疫生物傳感器示意圖及材料合成路線

在這項(xiàng)工作中，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種基于上轉(zhuǎn)換納米顆粒（UCNPs，NaYF?: Yb3?,Er3?）的側(cè)流免疫傳感器。該傳感器能夠同時(shí)產(chǎn)生比色、熒光及拉曼信號(hào)。其系統(tǒng)原理及結(jié)構(gòu)圖如圖1所示。將上轉(zhuǎn)換納米顆粒在試紙條T線上單層修飾，熒光信號(hào)的靈敏度得到了保證。

當(dāng)待測(cè)樣品中含有目標(biāo)miRNA時(shí)，結(jié)合墊上含有拉曼報(bào)告分子的金屬納米顆粒Au-DTNB@Ag與miRNA特異性結(jié)合。然后該復(fù)合體被T線上的核酸探針捕獲形成三明治結(jié)構(gòu)。由于Au-DTNB@Ag在T線上的大量聚集，比色及拉曼信號(hào)增強(qiáng)，而熒光信號(hào)被猝滅。因此，這種基于上轉(zhuǎn)換納米顆粒的多模側(cè)流免疫傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)miRNA的特異性檢測(cè)。

上轉(zhuǎn)換納米顆粒的表征及信號(hào)增強(qiáng)策略如圖2所示。該傳感器熒光信號(hào)的低檢測(cè)下限主要來源于試紙條的纖維素結(jié)構(gòu)。纖維素復(fù)雜的多孔狀結(jié)構(gòu)不僅可以在單位面積下容納更多的熒光納米顆粒，同時(shí)上轉(zhuǎn)換納米顆粒的單層修飾保證了供體與受體的充分接觸。當(dāng)試紙條干燥時(shí)，其內(nèi)部纖維素結(jié)構(gòu)坍塌，進(jìn)一步增進(jìn)了供受體之間的距離，增加了靈敏度。此外，修飾在T線的熒光納米顆粒減小了試紙條的孔徑，同樣也使試紙條的靈敏度增加（圖2e ~ 2f）。

圖2 上轉(zhuǎn)換納米顆粒的形態(tài)結(jié)構(gòu)、表征和性能

以miRNA-21為模版，研究人員對(duì)試紙條的檢測(cè)性能進(jìn)行了考察，反應(yīng)時(shí)間為20 min。隨著待測(cè)miRNA濃度的增加。試紙條的三種信號(hào)發(fā)生了變化。肉眼檢出限為10 pM，比色、熒光及拉曼檢測(cè)范圍分別為2 nM ~ 1 pM、1 nM ~ 1 fM和1 nM ~ 1 pM（圖3）。

圖3 側(cè)流免疫傳感器的應(yīng)用性能評(píng)估

另外，為了減少使用步驟，量化使用條件，研究人員設(shè)計(jì)了熒光-拉曼雙檢測(cè)光路用來同時(shí)進(jìn)行熒光-拉曼信號(hào)的檢測(cè)（圖4a）。在該光路下進(jìn)行檢測(cè)，試紙條穩(wěn)定性、特異性均能得到保證（圖4b ~ 4f）。試紙條還可用于實(shí)際樣本檢測(cè)。在模擬體液樣本（圖4g）、真實(shí)唾液和血清樣本中均檢測(cè)到了信號(hào)的變化。可通過miRNA-155明確區(qū)分牙周炎患者和正常人（圖4h），并通過miRNA-21區(qū)分肺癌患者和正常人（圖4i）。其結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果一致。

圖4 生物傳感器的應(yīng)用性能評(píng)估和實(shí)際應(yīng)用

綜上所述，本研究介紹了一種檢測(cè)體液中microRNA的多模側(cè)流免疫生物傳感器。通過在試紙條上組裝上轉(zhuǎn)換納米顆粒和核殼納米顆粒Au-DTNB@Ag，該傳感器可以同時(shí)產(chǎn)生熒光、比色和拉曼信號(hào)。將上轉(zhuǎn)換納米顆粒單層修飾在條帶上極大地增加了熒光檢測(cè)的靈敏度。使用 microRNA-21 作為分析物模型，該傳感器的檢測(cè)范圍在2nM ~ 1fM。

另外，該傳感器能夠應(yīng)用在人工和真實(shí)體液樣本中。利用熒光-拉曼雙信號(hào)檢測(cè)光路，該系統(tǒng)可在20分鐘內(nèi)同時(shí)對(duì)多個(gè)信號(hào)進(jìn)行定量檢測(cè)，為檢測(cè)體液中的miRNA提供了一種靈活的方法，也為側(cè)流免疫傳感器的開發(fā)提供了參考。

審核編輯：劉清