抗生素是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的藥物，用于治療各種細(xì)菌疾病，提高飼料利用率，并減少對(duì)某些營(yíng)養(yǎng)素的需求。迄今為止，科學(xué)家已經(jīng)建立了高效液相色譜法、質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法等多種抗生素分析技術(shù)。然而，盡管這些方法靈敏度高，但樣品前處理復(fù)雜、儀器昂貴、勞動(dòng)強(qiáng)度高、人員訓(xùn)練有素，極大地限制了其應(yīng)用。與納米材料結(jié)合的熒光檢測(cè)技術(shù)具有檢測(cè)限超低、實(shí)時(shí)快速檢測(cè)、檢測(cè)范圍大、成本低等無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于抗生素的檢測(cè)。 近年來(lái)，核酸適配體技術(shù)已經(jīng)成為食品摻假和污染物快速檢測(cè)的領(lǐng)跑者。

與抗體相比，核酸適配體表現(xiàn)出更好的特性，包括更高的親和力、更高的特異性、更高的穩(wěn)定性和更容易標(biāo)記。目前，已有研究人員開發(fā)出了一種基于信號(hào)放大策略的雙目標(biāo)電化學(xué)適配體傳感器，用于高靈敏度地同時(shí)檢測(cè)卡那霉素和鏈霉素。然而，目前還沒(méi)有紙基微流控適配體傳感器與熒光納米顆粒結(jié)合用于抗生素的多重檢測(cè)。 基于此，江南大學(xué)吳世嘉教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種基于多色熒光碳點(diǎn)（CDs）適配體傳感器的激光打印紙基微流控芯片（mCD-μPAD適配體傳感器），實(shí)現(xiàn)了多種抗生素的同時(shí)檢測(cè)。

此外，還設(shè)計(jì)了一種3D打印的便攜式檢測(cè)盒，可以通過(guò)智能手機(jī)直觀地分析磺胺二甲嘧啶（SMZ）、土霉素（OTC）和氯霉素（CAP）。通過(guò)智能手機(jī)識(shí)別熒光紙張圖像的RGB值，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)水產(chǎn)品中多種抗生素的同時(shí)可視化檢測(cè)。文章以“Laser-Printed Paper-Based Microfluidic Chip Based on a Multicolor Fluorescence Carbon Dot Biosensor for Visual Determination of Multiantibiotics in Aquatic Products”為題發(fā)表在ACS Sensors期刊上。

首先，研究人員通過(guò)水熱法合成了多色熒光CDs，然后與抗生素適配體和MoS?納米片結(jié)合，合成了“熒光關(guān)閉”檢測(cè)納米探針，如方案1A所示。然后，在自行設(shè)計(jì)的激光打印微流控紙基芯片的三個(gè)檢測(cè)區(qū)重復(fù)滴加三個(gè)檢測(cè)納米探針溶液，制成方案1B中的mCD-μPAD適配體傳感器。檢測(cè)過(guò)程如方案1C所示。

在沒(méi)有靶點(diǎn)的情況下，CDs通過(guò)π-π堆積作用與MoS?納米片形成的CDs-apt導(dǎo)致mCD-μPAD上的熒光猝滅，這可以促進(jìn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）過(guò)程的形成。然而，當(dāng)樣品溶液被mCD-μPAD適配體傳感器吸附時(shí)，溶液中的抗生素會(huì)在濾紙的毛細(xì)作用下遷移到檢測(cè)區(qū)。然后，它們各自的適配體特異性地識(shí)別它們，并形成伴隨構(gòu)象變化的適配體/靶點(diǎn)復(fù)合體。

在這種情況下，CDs和MoS?之間的距離變大，阻礙了能量的傳遞。通過(guò)便攜式檢測(cè)設(shè)備和可用的智能手機(jī)拍攝檢測(cè)區(qū)域中的熒光顏色變化，可以通過(guò)安裝的顏色識(shí)別應(yīng)用程序提取捕獲的熒光圖像或?qū)崟r(shí)圖像的RGB通道值，并將其轉(zhuǎn)換為灰度值。圖像的灰度值與抗生素的濃度成正比。

方案1 mCD-μPAD適配體傳感器和便攜式智能手機(jī)檢測(cè)儀同時(shí)檢測(cè)多種抗生素

制備的三種CDs為分散均勻的球狀顆粒，平均粒徑分別為3.49 nm ± 0.63 nm、4.74 nm ± 0.65 nm和5.03 nm ± 0.69 nm（圖1a-1c）。三種CDs的紅外光譜相似，都具有C-O-C（1195/cm、1166/cm和1145/cm）、C-N（1417/cm、1394/cm和1400/cm）、C=O（1720/cm、1627/cm和1621 /cm）和O-H/N-H（3502/cm、3413/cm和3437/cm）伸縮振動(dòng)和N-H（779/cm、827/cm和912/cm）彎曲振動(dòng)（圖1d-1f）。用X射線光電子能譜對(duì)三種CDs的表面元素分析表明，多色CDs含有原子含量不同的C（284.8 eV）、N（400 eV）和O（531 eV）（圖1g?1i）。



圖1 （a）rCDs、（b）gCDs和（c）bCDs的TEM圖像和粒徑分布直方圖；（d）rCDs、（e）gCDs和（f）bCDs的FT-IR光譜；（g）rCDs、（h）gCDs和（i）bCDs的XPS譜 用UV-Vis吸收光譜、熒光激發(fā)和發(fā)射光譜研究了多色熒光CDs的光學(xué)性質(zhì)（圖2a-2c）。三種CDs在530 nm、360 nm和370 nm處的吸收帶分別與614 nm、490 nm和470 nm處的發(fā)射的激發(fā)光譜重疊。

rCDs在530 nm吸收峰歸屬于C=N鍵，gCDs和bCDs的360 nm和370 nm吸收峰歸屬于碳核的n→π*躍遷。在激發(fā)波長(zhǎng)為518 nm、362 nm和374 nm時(shí)，三種CDs的最大發(fā)射波長(zhǎng)分別為614 nm、493 nm和439 nm。



圖2 （a）rCDs、（b）gCDs和（c）bCDs的熒光和吸收光譜

通過(guò)ζ電位表征了適配體與CDs的結(jié)合（圖3a-3c）。rCDs、gCDs和bCDs的ζ電勢(shì)分別在-2.33 mV ~ -11.7 mV、-8.81 mV ~ -12.2 mV和-8.86 mV ~ -14.7 mV之間變化，這是由于適配體磷酸骨架上豐富的負(fù)電荷。如圖3d-3f所示，在CDs-apt中添加MoS?復(fù)合材料顯著猝滅了熒光強(qiáng)度（c線），在CDs直接摻入MoS?后，發(fā)光強(qiáng)度僅輕微猝滅（b線）。

此外，隨著靶點(diǎn)的加入，復(fù)合體系（CDs-apt-MoS?）的熒光強(qiáng)度顯著恢復(fù)（d線）。此外，還驗(yàn)證了在μPAD上安裝檢測(cè)探針的可行性。μPAD在365 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的檢測(cè)區(qū)的熒光強(qiáng)度按a、b、d、c的順序逐漸減小，這與溶液中的結(jié)果一致。



圖3 （a）rCDs和rCDs-atp1、（b）gCDs和gCDs-atp2、以及（c）bCDs和bCDs-atp3的ζ電勢(shì)；（d）rCDs-atp1-MoS?、（e）gCDs-atp2-MoS?和（f）bCDs-atp3-MoS?納米探針在溶液中檢測(cè)抗生素的可行性

如圖4a所示，整個(gè)μPAD是半徑為30 mm的扇區(qū)。三種不同形狀的檢測(cè)區(qū)域和三個(gè)圓形緩沖區(qū)通過(guò)三個(gè)微通道與親水尖端相連。使用緩沖區(qū)，以避免由于檢測(cè)過(guò)程中液體流動(dòng)速度過(guò)快而導(dǎo)致檢測(cè)探頭堆積在檢測(cè)區(qū)域的上部。圖4b、4c顯示了白天和365 nm激發(fā)光打印的多色熒光碳點(diǎn)附著在μPAD的照片。

通過(guò)掃描電子顯微鏡技術(shù)，可以認(rèn)為檢測(cè)區(qū)浸入了CDs -apt -MoS?納米探針。圖4d、4e顯示了不同尺度下μPAD的空白檢測(cè)區(qū)，其中只能觀察到濾紙的纖維組織。在圖4f中，可以觀察到它們附著在纖維素過(guò)濾器的表面，并在將納米探針滴到檢測(cè)區(qū)后在一定程度上聚集在一起。

為了獲得更好的檢測(cè)性能，對(duì)MoS?的負(fù)載濃度和靶點(diǎn)孵育時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。從圖4g-4i中可以看出，隨著MoS?在納米探針中濃度的增加，相應(yīng)濃度的μPAD的灰度值和熒光圖像都逐漸下降，紅色和綠色探針?lè)€(wěn)定在0.25 mg/mL，藍(lán)色探針?lè)€(wěn)定在0.30 mg/mL。

因此，rCDs和gCDs探針的最佳濃度為0.25 mg/mL MoS?，bCDs探針的最佳濃度為0.30 mg/mL MoS?。此外，通過(guò)確定抗生素濃度（100 ng/mL）來(lái)優(yōu)化目標(biāo)孵育時(shí)間。結(jié)果表明，所有顏色的灰度值隨著時(shí)間的推移而逐漸增加，并在15分鐘時(shí)趨于穩(wěn)定（圖4j-4i）。因此，15 min為最佳孵化時(shí)間。



圖4 （a）μPAD的示意圖；μPAD在日光下（b）和在365 nm紫外光下附著多色熒光碳點(diǎn)的照片；在（d）100 μm和（e）10 μm處添加檢測(cè)探針之前的檢測(cè)區(qū)的掃描電子顯微鏡圖像；（f）在10 μm處添加檢測(cè)探針之后的檢測(cè)區(qū)的掃描電子顯微鏡圖像；（g）rCDs檢測(cè)探針、（h）gCDs檢測(cè)探針和（i）bCDs檢測(cè)探針的MoS?濃度的優(yōu)化；（j）rCDs檢測(cè)探針、（k）gCDs檢測(cè)探針和（i）bCDs檢測(cè)探針的孵育時(shí)間的優(yōu)化

通過(guò)便攜設(shè)備平臺(tái)和智能手機(jī)同時(shí)檢測(cè)SMZ、OTC和CAP。此外，為了使mCD-μPAD適配體傳感器可用于抗生素的現(xiàn)場(chǎng)定量，并提供穩(wěn)定的分析環(huán)境，設(shè)計(jì)了一種3D打印的便攜式檢測(cè)裝置。該設(shè)備的組成和結(jié)構(gòu)的照片如圖5a、5b所示。它由一個(gè)由電池供電的365 nm紫外光和一個(gè)帶有高質(zhì)量互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體相機(jī)的智能手機(jī)組成。檢測(cè)過(guò)程如圖5c所示。檢測(cè)后，將μPAD放入裝置托盤，在365 nm激發(fā)光源下激發(fā)。智能手機(jī)被放置在盒子的頂部，通過(guò)觀察孔捕捉到平板的熒光信號(hào)。

在最佳條件下，用mCD-μPAD適配體傳感器對(duì)SMZ、OTC和CAP進(jìn)行可視化檢測(cè)。如圖5d-5f所示，隨著標(biāo)準(zhǔn)樣品中SMZ、OTC和CAP濃度的增加，rCDs、gCDs和bCDs的熒光強(qiáng)度逐漸恢復(fù)。然后，通過(guò)顏色識(shí)別軟件提取熒光圖像的RGB值，并將其轉(zhuǎn)換為灰度值，通過(guò)公式進(jìn)行計(jì)算，相應(yīng)的檢出限分別為0.47 ng/mL、0.48 ng/mL和0.34 ng/mL。



圖5 便攜式檢測(cè)裝置的（a）制備、（b）組成和（c）使用的示意圖；mCD-μPAD適配體傳感器的熒光圖像以及（d）紅、（e）綠和（f）藍(lán)檢測(cè)區(qū)域的Δ灰度值與對(duì)數(shù)的SMZ、OTC和CAP濃度之間的校準(zhǔn)曲線 用該方法檢測(cè)了水產(chǎn)品中可能存在的磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺二甲氧嘧啶（SMS）、四環(huán)素（TC）、恩諾沙星（ENR）和紅霉素（ERY）等幾種常見(jiàn)抗生素。其中，SDZ和SMS是SMZ的結(jié)構(gòu)類似物，TC是OTC的結(jié)構(gòu)類似物。如圖6所示，這些抗生素僅引起較小的灰度值變化。相比之下，SMZ、OTC和CAP可導(dǎo)致相應(yīng)檢測(cè)區(qū)域的顯著增加。



圖6 mCD-μPAD適配體傳感器的特異性和交叉反應(yīng)性

綜上所述，該研究利用多色熒光發(fā)射N-CDs和MoS?納米片作為FRET供體?受體對(duì)，成功構(gòu)建了一種多色熒光納米探針紙基微流控芯片，可同時(shí)監(jiān)測(cè)3種常用抗生素。使用3D打印便攜設(shè)備和現(xiàn)有的智能手機(jī)，可以通過(guò)安裝的顏色識(shí)別應(yīng)用程序?qū)崿F(xiàn)熒光圖像的快速捕獲和RGB通道值的即時(shí)分析。

通過(guò)改變相應(yīng)的適配體，μPAD可應(yīng)用于其他抗生素的檢測(cè)。在進(jìn)一步的研究中，將努力分散在微型光學(xué)配件的設(shè)計(jì)上，以減輕檢測(cè)系統(tǒng)的重量和體積，并開發(fā)智能手機(jī)應(yīng)用程序，整合圖像處理和數(shù)據(jù)分析，提高性能?？傮w而言，該紙基傳感器具有試劑消耗低、檢測(cè)成本低、制作簡(jiǎn)單、靈敏度高、效率高等優(yōu)點(diǎn)，為食品安全與控制的同步監(jiān)測(cè)提供了一種很有前途的策略。

審核編輯：劉清